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金梅林教授團隊在SARS-CoV-2 RNA基因組結構動態變化研究中取得新進展

核心提示: 9月28日,我校金梅林教授團隊聯合軍事科學院軍事醫學研究院趙志虎研究組、英國愛丁堡大學Grzegorz Kudla組和武漢菲沙基因等團隊在SARS-CoV-2 RNA基因組結構動態變化上的研究成果以題為“In vivo structure and dynamics of the SARS-CoV-2 RNA genome”發表於國際期刊Nature Communications。

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南湖新聞網訊(通訊員 黃坤)9月28日,我校金梅林教授團隊聯合軍事科學院軍事醫學研究院趙志虎研究組、英國愛丁堡大學Grzegorz Kudla組和武漢菲沙基因等團隊在SARS-CoV-2 RNA基因組結構動態變化上的研究成果以題為“In vivo structure and dynamics of the SARS-CoV-2 RNA genome”發表於國際期刊Nature Communications。

該研究全面繪製了SARS-CoV-2在整個生命週期的體內RNA-RNA相互作用,提供了轉錄調節序列(TRS-L 和 TRS-Bs)之間相互作用的第一個直接證據,發現其基因組 RNA 經歷了強烈的壓縮,但基因組結構域保持穩定,結構域特徵信號增強,全局環化減弱。該研究為病毒複製、不連續轉錄和翻譯移碼的調節提供了結構基礎,描述了SARS-CoV-2生命週期中RNA結構的動態變化,將有助於人們開發出更好的抗病毒策略。

研究者鑑定出了對於SARS-Cov-2複製和不連續轉錄至關重要的5'-UTR的全部五個保守莖環結構(SL1-SL5),並且在3' stem-loop II-like motif (S2M)區域鑑別到一個替代的3'-UTR結構。在互作矩陣中,研究者發現了SARS-CoV-2基因組5'-end和3'-end之間的相互作用,確定了基因組環化(genome cyclization)現象並推測其與複製/包裝有關。

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圖1 實驗設計和不同感染階段SARS-CoV-2的RNA互作圖譜

RNA鄰近連接反應能得到RNA-RNA相互作用信息,其中包含一部分剪切本之間的連接,也包含sgRNA自身及其與宿主RNA因空間鄰近而連接的嵌合分子。為了正確識別RNA-RNA相互作用,研究者評估了已發佈的SARS-CoV-2感染細胞RNA-Seq數據集,確定了三個特徵來將RNA-Seq中發現的大多數sgRNA嵌合體與真正的鄰近連接嵌合體區分開來:sgRNAs幾乎完全以5'-3'方向連接,而RNA鄰近連接嵌合體可以為5'-3'方向和3'-5'方向;嵌合體臂之間的連接點精確定位在sgRNAs中,而鄰近連接中的連接位點是可變的;sgRNA嵌合體通常包括嵌合體的TRS-L和TRS-B側之間的同源區域 ,而鄰近連接嵌合體通常不包括這樣的區域。

研究者通過調整分析流程參數可以檢測或去除RNA-Seq數據中大多數sgRNA嵌合體,使用嚴謹參數流程來分析鄰近連接數據,同時過濾掉sgRNA。通過分析5'-3'和 3 '-5'嵌合體以識別由TRS-L介導的RNA-RNA相互作用,並分析TRS-L連接位點的分佈,發現可以區分實驗數據中TRS-L介導的RNA-RNA相互作用和TRS-L依賴的sgRNA。遠程相互作用介導的RNA鹼基配對錶明TRS-L可能與TRS-B區域穩定結合。有趣的是, TRS-L通常不與確切的TRS-B序列相互作用,而是與50nt內的側翼序列相互作用,這可能是為下一步配對Ccs-B和模板轉換提供靈活性。

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圖2 TRS-L與經典TRS-B位點的互作

除了經典的sgRNA,研究者還觀察到與TRS-L相互作用的其他區域,並通過RT-PCR和Sanger測序驗證TRS-L介導的相互作用會產生新的候選sgRNA。這些新的sgRNA沒有經典的ACGAAC 核心序列motif,但與其存在部分overlap,表明TRS-L和負鏈上的部分cCS-B的鹼基配對對於這些sgRNA不連續轉錄過程中的模板轉換至關重要。

SARS-Cov-2的一個特徵是使用程序化的核糖體移碼來促進ORF1b編碼RdRp的翻譯並控制其蛋白質的相對錶達。研究者分析了移碼元件(FSE)的相互作用,不僅發現了之前已經報道的三莖假結結構,還發現了更大的嵌有FSE的穩定莖環(arch1)的可選擇局部結構,以及多種由FSE介導的遠程相互作用,並鑑定得到多個強遠程互作,利用三維建模對其進行了可視化。

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圖3 局部可變及遠程的FSE結構

研究者通過相關性分析、主成分分析和差異分析展示了病毒生命週期各個階段的互作動態,結果表明,與細胞組和裂解組相比,病毒衣殼中SARS-CoV-2基因組的三分之一的相互作用密度較低、基因組環化減少,然而病毒粒子和裂解細胞中近端和長程相互作用在增加,意味着基因組在包裝成病毒粒子期間發生壓縮,TRS-L區域介導的相互作用的變化則可能反映了病毒基因組包裝的第一步。研究者還發現,病毒粒子長距離loop的差異互作中,減弱的相互作用幾乎總是由sgRNA介導,而L組較C組也出現這種現象,表明RNA相互作用和構象在病毒包裝過程中逐漸發生變化,sgRNAs丰度可能在減少。

簡化的SPLASH數據熱圖類似於哺乳動物基因組Hi-C數據 ,研究者應用insulation score算法檢查SARS-CoV-2基因組RNA是否被劃分為domain,以及基因組RNA的整體壓縮是否會導致domain的破壞,結果發現在基因組壓縮和包裝期間,domain結構不僅保留了,而且還得到了加強。最後,研究者通過計算SARS-CoV-2基因組的Shannon entropy value發現,細胞組比病毒粒子中的RNA有更靈活的結構,結構域邊界的靈活性,可能是更有吸引力的藥物設計靶點。

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圖4  SARS-CoV-2生命週期不同階段的RNA互作動態

該研究簡化了SPLASH方法,捕獲了多個階段的SARS-CoV-2中RNA-RNA相互作用,觀察到了RNA經典和替代結構,包括 5'-UTR 和 3'-UTR、移碼元件 (FSE) 假結和基因組環化,揭示了FSE附近的短距離和長距離arch形成嵌入FSE的“高階假結”, 描述了SARS-CoV-2生命週期中RNA結構的動態變化,為其複製、不連續轉錄和翻譯移碼的調節提供了結構基礎,將有助於人們開發出更好的抗病毒策略。

我校動科動醫學院博士研究生黃坤、軍事醫學研究院張彥以及武漢菲沙基因謝德健為該論文的共同第一作者,我校金梅林教授、軍事醫學研究院趙志虎研究員、英國愛丁堡大學Grzegorz Kudla研究員為共同通訊作者。

原文鏈接://www.nature.com/articles/s41467-021-25999-1

審核人 金梅林

責任編輯:蔣朝常